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Científicos estudian la función del genotipo local del virus dela hepatitis B en el cáncer de hígado

Investigadores de la Facultad de Ciencias Biológicas y la Fundación Ciencia & Vida pretenden comprender los mecanismos moleculares de la replicación del virus de la hepatitis B y su vínculo con el desarrollo del cáncer de hígado.

 

En Chile, cada año alrededor de mil personas -5.5 de cada 100 mil habitantes- mueren debido al cáncer de hígado, el cual afecta con mayor frecuencia a hombres que a mujeres. Históricamente esta enfermedad ha sido asociada al consumo excesivo de alcohol, sin embargo, recientemente se ha incorporado al virus de la hepatitis B entre los factores de riesgo de esta patología. Según el Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos entre un 10% y un 20% de las personas infectadas con este virus desarrollarán una infección viral crónica persistente, la que podría causar cirrosis y cáncer hepático a largo plazo.

Sin embargo, el vínculo entre el virus y la enfermedad aún no está del todo claro. Avanzar en el conocimiento en torno a esta relación es uno de los objetivos del proyecto Conicyt Anillos liderado por el Dr. Rodrigo Villanueva de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Andrés Bello y en el cual participan el Dr. Giancarlo De Ferrari del Centro de Investigaciones Biomédicas de la UNAB, y la Dra. Alejandra Loyola de la Fundación Ciencia &Vida. El proyecto adjudicado se titula “Mecanismos moleculares del cáncer: examinando la función de la cromatina en la replicación de HBV y leucemia”, y actualmente está en sus primeros meses de ejecución.

Los estudios globales sobre el virus de la hepatitis B que se han realizado en Estados Unidos y en Europa se han concentrado en los genotipos A, B y C, que son los más prevalentes en esas regiones. Sin embargo, no consideran el genotipo F, presente principalmente en Sudamérica. “En un estudio previo realizado sobre cerca de 200 muestras circulantes en Chile, encontramos que el genotipo F está presente en más del 80% de los casos en nuestra población, lo que en ese momento no se sabía”, explica el Dr. Villanueva, quien participó en el trabajo en colaboración con la Sección de Gastroenterología del Hospital Clínico de la Universidad de Chile.

Por esta razón, el trabajo de los investigadores en este proyecto se concentrará en este genotipo del virus de la hepatitis B, con lo que esperan poder ahondar en la importancia del patógeno para el desarrollo del cáncer de hígado en Chile. “En la actualidad no existen grupos que investiguen este fenómeno a nivel básico en el país”, explica el Dr. Villanueva, quien aclara que “nuestro equipo es multidisciplinario, abarcando aspectos clínicos, moleculares, y de virología del virus de la hepatitis B”.

“Uno de nuestros objetivos generales es desarrollar un sistema de cultivo celular del virus de la hepatitis B, a partir de un clon molecular obtenido de un paciente chileno con infección crónica, genotipo F, estudio que ya tenemos bastante avanzado”, agrega Villanueva. Con este sistema, se busca poder estudiar específicamente y por primera vez este genotipo viral que está significativamente presente no sólo en Chile, sino en gran parte de Sudamérica, y poder compararlo con los otros genotipos que sí han sido extensivamente estudiados previamente.

Para esto, se analizaron 20 muestras de pacientes infectados, se clonó el material genético viral, y se secuenció por completo. De todas las muestras secuenciadas, sólo una de estas resultó ser posiblemente funcional, es decir, que tenía todas las partes (o regiones genéticas virales) que se esperaba que tuviera, en el lugar que debían estar, y que esas regiones genéticas estaban en buen estado, libre de mutaciones, y por lo tanto, podrían ser capaces de producir virus, una vez introducido este material genético al interior de una célula apropiada, en el laboratorio. Este trabajo fue extremadamente exigente, largo, y complejo, y fue desarrollado por Sergio Hernández, quien acaba de ingresar al Doctorado de Biotecnología de la UNAB, en el laboratorio del Dr. Villanueva.

Así, el material genético viral que se había seleccionado como “probablemente funcional”, se introdujo al interior de células en el laboratorio, y actualmente los investigadores están estudiando si es capaz o no de multiplicarse, es decir, de producir virus de la hepatitis B genotipo F,  al interior de la célula. Lo que están haciendo es reproducir o imitar la infección que se produce en el hígado de un paciente, pero en un sistema de células hepáticas crecidas en laboratorio.

Una de las evidencias de que este es un sistema efectivamente funcional, o sea, de que se está produciendo una infección viral en estas células de laboratorio, proviene de estudios de microscopía electrónica realizados por Francisca Muñoz, estudiante de Doctorado de Biotecnología de la UNAB, en el laboratorio de la Dra. Loyola. Con esta técnica, a las células individuales observadas bajo este tipo de microscopios “se les hace un zoom” de miles de veces de aumento, hasta poder observar y distinguir claramente distintas regiones celulares. Al analizar el interior de las células a las que se les introdujo el material genético viral obtenido en nuestro laboratorio, hemos podido observar la presencia de partículas virales o virus.

Dado que los investigadores han observado estos virus al interior de la célula, creen que son virus que están siendo formados y que están en camino a abandonar la célula en se formaron para salir e infectar otra. De esta forma continúan con el ciclo viral, multiplicándose.

 

La figura muestra la visualización de partículas virales del virus de la hepatitis B genotipo F al interior de la célula, a través de microscopía electrónica de transmisión, y tinción negativa.

 

Una segunda parte del primer objetivo es estudiar la regulación de la proteína viral HBx, la que se ha asociado sistemáticamente con el desarrollo de cáncer al hígado en pacientes infectados crónicamente con HBV. Los académicos estudiarán el rol de las modificaciones posttraduccionalesen la regulación de esta proteína viral, particularmente la fosforilación.

Estas “modificaciones posttraduccionales” son “marcas químicas” que se agregan en algunas proteínas, temporal o definitivamente, y que además de producir una alteración en la morfología de la proteína, de alguna manera les fija el destino, es decir, algunas quedan así “activadas” o “inactivadas” para cumplir con un determinado rol.  Se sabe que este tipo de modificación está muy presente en variadas proteínas tanto celulares como varias otras oncogénicas, pero este mecanismo no se ha investigado para la proteína HBx del virus B.

Por medio de análisis bioinformáticos, y de modelamiento molecular, los académicos encontraron que esta proteína viral tiene una alta probabilidad de ser fosoforilada (marcada) en algunos puntos específicos de su estructura, y por lo tanto, el estudio de estas marcas químicas podrían contribuir a entender dónde y en qué situación esta proteína es marcada para ser más activa o menos activa, y qué funciones lleva a cabo en cada caso.

El potencial de este conocimiento es muy relevante, ya que daría la oportunidad de intervenir, por ejemplo a través de una molécula interferente que impida o favorezca que esta marca se produzca en la proteína viral, dependiendo de cuál sea el caso. Dado a que esta proteína está asociada a la generación del cáncer en pacientes infectados con el virus B, diseñar terapias en ese punto sería la gran proyección obvia, y lo que se ha llevado a cabo en otros casos similares.

 

La figura muestra un modelo tridimensional de la estructura proteína HBx del virus de la hepatitis B, genotipo F. Los colores indican distintas regiones independientes dentro de la proteína. Con flechas, se indican las posiciones de los tres residuos de amino ácidos con alto potencial de ser fosforilados: serinas 25 y 41, y treonina 81.

 

Por otra parte, en colaboración con el Dr. Giancarlo De Ferrari, investigador principal del proyecto, los científicos estudiarán este tipo de regulación de la proteína viral HBx y su interacción con una vía de transducción de señales, con foco en la activación de la vía conocida como “Wnt-ß catenina”, que se sabe que está alterada en células crónicamente infectadas con el virus de la hepatitis B, y que también se ha propuesto que contribuye al desarrollo de cáncer hepático. Todos estos resultados que serán tremendamente relevantes de conocer para entender más el rol de HBx en la patogenia viral.

Un segundo objetivo general de este proyecto, y también muy relevante, es examinar la estructura y regulación de la cromatina en la replicación viral al interior de las células, aspecto que será liderado por la Dra. Alejandra Loyola. “La cromatina es la forma como se organiza el material genético en nuestras células, los conocidos cromosomas celulares, que se ubican en el núcleo de todas nuestras células. De manera homóloga, el genoma ADN del virus de la hepatitis B dentro del núcleode la célula infectada igualmente se organiza como cromatina, aunque es independiente del cromosomal, es extracromosomal.” Estudiar y entender la estructura, arquitectura, y funciones de este “minicromosoma viral” podría permitir comprender cómo el virus organizay lleva a cabo su multiplicación desde el núcleo celular, y cuál es el rol que cumple esta regulación -o eventualmente desregulación-de la cromatina de su minicromosomaen el desarrollo del cáncer hepático.

La Dra. Alejandra Loyola explica que algunos estudios en el extranjero “han demostrado una correlación entre algunas alteraciones a nivel de cromatina viral y la cantidad de virus que existe en la sangre de un paciente”. Sin embargo, queda mucho por investigar y dado a que son muy pocos los grupos que están estudiando este fenómeno, el avance en el conocimiento ha sido lento. Para aproximarse a una respuesta, el equipo utilizará su sistema de cultivo celular del virus de la hepatitis B, desde donde esperan poder estudiar la cromatina del minicromosoma viral.

Otro objetivo de esta investigación es poder identificar soluciones terapéuticas para detener la replicación del virus de la hepatitis B a nivel intracelular. Para esto, se realizarán “screenings primarios” (o selección primaria o preliminar) sobre una base de familias de distintas drogas de amplio espectro, para ver si alguna de ellas, preliminarmente, tiene el efecto esperado, es decir,interferir o bloquear la multiplicación del virus al interior de la célula, o sea, actuar como un posible antiviral. Además, “desarrollaremos una estrategia más específica, buscando enzimas blanco o drogas que afecten la regulación de la estructura de la cromatina viral”, explica la Dra. Loyola. Para esto, los investigadores tendrán acceso a librerías de familias de compuestos químicos con potencial terapéutico, con uno de sus colaboradores, en el extranjero.

La realización de este proyecto ha permitido a los académicos consolidar una activa colaboración con el Center of Predictive Medicine, University of Louisville, USA, y su foco estará centrado en la búsqueda de moléculas pequeñas que inhiban la replicación viral teniendo como blanco alteraciones funcionales de la cromatina viral.

Este proyecto de investigación colaborativa tiene una duración de tres años y es financiado por el Programa de Investigación Asociativa de CONICYT.