dPCR Qiagen

El Laboratorio Constantine Paton está equipado con tecnología avanzada de PCR digital (dPCR) de Qiagen, una técnica de última generación para la cuantificación precisa y absoluta de ácidos nucleicos, tanto ADN como ARN, sin la necesidad de curvas estándar.

¿Qué es el dPCR?

 

El digital PCR (dPCR) es una técnica que permite medir con alta precisión la cantidad de ADN o ARN en una muestra al dividirla en miles de reacciones individuales. Estas reacciones se realizan en nanoplacas, que están disponibles en dos formatos: Nanoplacas con 8.500 pocillos independientes, capaces de procesar hasta 24 muestras simultáneamente, y Nanoplacas con 26.000 pocillos independientes, que pueden analizar hasta 8 muestras simultáneamente.

Gracias a la independencia de estas reacciones, la sensibilidad incrementa permitiendo detectar señales genéticas muy débiles, lo que se traduce en una mejora significativa en la detección de variaciones en el número de copias de uno o más genes específicos. Se puede aplicar para la detección de mutaciones raras ideal para identificar variaciones genéticas poco frecuentes con gran exactitud, análisis de variaciones en el número de copias detecta con precisión cambios en la cantidad de copias de genes específicos, esencial en estudios genéticos y de diagnóstico.

El equipo cuenta con un software avanzado que realiza automáticamente el cálculo de valores para análisis de cuantificación absoluta, detección de mutaciones, edición del genoma, variaciones en el número de copias y estudios de expresión génica.

Características dPCR Qiagen

 

• Tecnología de Nanoplacas (Nanoplates): utiliza nanoplacas con 8.500 o 26.000 pocillos independientes para realizar reacciones digitales de PCR. Estas nanoplacas están diseñadas para garantizar una partición eficiente y precisa de las muestras, lo que permite una alta sensibilidad en la detección de moléculas target.
• Cuantificación Absoluta: permite la cuantificación absoluta de ADN o ARN sin necesidad de curvas estándar, proporcionando resultados precisos y reproducibles.
• Multiplexación: capacidad para realizar análisis multiplex utilizando sondas, lo que permite la detección simultánea de múltiples target en una única reacción, ahorrando tiempo y recursos.
• Alta Sensibilidad: ideal para la detección de mutaciones raras, variaciones en el número de copias y cuantificación de biomarcadores, gracias a su alta sensibilidad y especificidad.
• Rápida Tasa de Proceso: reducción del tiempo de ciclo en comparación con otros sistemas de dPCR, acelerando el tiempo total de los experimentos.
• Escalabilidad: adecuado tanto para estudios de bajo como de alto rendimiento, con la flexibilidad de procesar desde pocas muestras hasta grandes cantidades en un solo ciclo.

Recomendaciones para el diseño de primers y Sondas

 

Es importante el diseño óptimo de primers y sondas, procurando minimizar la hibridación no específica de primers y sondas, es fundamental destacar que el producto de PCR puede variar desde los 60 bp hasta los 150 bp.

Para el diseño de Sondas (Probes)

• La Tm de los primers pueden variar entre los 58-62 ºC, con una diferencia máxima en temperatura de 2 ºC.
• La Tm de las sondas debe ser 8-10 ºC mayor que la Tm de los primers.
• Evitar una guanina en el extremo 5′ de las sondas, junto al reportero, porque esto causa extinción reduciendo o apagando la señal fluorescente emitida por el reportero.
• Evitar secuencias de 4 o más nucleótidos iguales, especialmente de guanina.
• Elegir la hebra de unión de manera que la sonda tenga más bases de C que de G.
• Todos los ensayos deben diseñarse utilizando los mismos parámetros para garantizar que funcionen de manera óptima bajo las mismas condiciones de ciclaje (60°C de hibridación/extensión).

Para el diseño de Primers

• Longitud: 18–30 nucleótidos.
• Contenido de GC: 30–70%.
• Verificar la especificidad de los primers.
• Asegurarse de que las secuencias de los primers sean específicas para su secuencia target.
• Verificar que los primers y sondas no sean complementarios entre sí.
• Tratar de evitar secuencias altamente repetitivas.
• Evitar la complementariedad de 2 o 3 bases en los extremos 3′ de los pares de primers para minimizar la formación de dímeros.
• Evitar discrepancias entre el extremo 3′ de los primers y la secuencia molde.
  Evitar secuencias de 3 o más Gs y/o Cs en el extremo 3′.
• Evitar secuencias complementarias dentro de una secuencia del primer y entre el par de primers.

¿Cómo funciona el Digital PCR de Qiagen?

 

• Preparación de la Muestra: La muestra de ADN o cDNA se mezcla con los reactivos de PCR, incluyendo primers, sondas y reactivos de amplificación (Kit EvaGreen o Kit Probe).
• Partición de la Muestra: La mezcla se distribuye en un Nanoplates que contiene miles de pocillos independientes (8.500 o 26.000, dependiendo del formato). Cada pocillo contiene una pequeña porción de la muestra y se realiza una reacción de PCR independiente en cada uno.
• Amplificación: Se realiza la amplificación en cada pocillo mediante ciclos de PCR, donde las secuencias target se amplifican en presencia de los primers/sondas específicas. La partición en pocillos independientes asegura que la amplificación en cada pocillo ocurra de manera aislada, lo que evita la interferencia entre reacciones.
• Detección: Una vez completada la amplificación, el sistema utiliza tecnología de detección para identificar y contar las moléculas amplificadas en cada pocillo. Esta detección puede ser realizada mediante fluorescencia, donde los productos amplificados emiten señales que son registradas por el equipo.
• Análisis de Datos: El software avanzado integrado calcula la cantidad absoluta de la secuencia target en la muestra, basándose en el número de pocillos que muestran señal positiva frente al número total de pocillos. Esto se traduce en una cuantificación precisa y directa del ADN o ARN sin necesidad de curvas estándar.
• Resultados: Los resultados son presentados como una concentración absoluta de la secuencia target en la muestra, permitiendo una interpretación precisa de los datos obtenidos en la reacción.

Seguridad

 

Para que el equipo de PCR digital QIAGEN funcione de manera eficiente se requiere la asistencia de un operador capacitado, contratado específicamente para este propósito. Por lo tanto, no es admisible que otros investigadores argumenten poseer credenciales que los habiliten como operadores del equipo y puedan utilizarlo sin la capacitación necesaria.

Es fundamental que los usuarios del servicio informen al operador sobre el tipo de muestra de ADN que se va a analizar, así como sobre los partidores (primers) y sondas que se utilizarán en el ensayo. Además, es importante que las muestras de ADN estén correctamente cuantificadas antes de la realización del ensayo, ya que esto optimiza la eficiencia de la reacción y asegura resultados precisos.